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熒光定量PCR耗材如何使用及選擇需注意事項 !

更新時間:2022-06-20    點(diǎn)擊次數(shù):1488

  本生生物詳解:高通量的96孔PCR板和8聯(lián)管是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)中,主要作為參與擴(kuò)增反應(yīng)的引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、模板核酸、Mg、緩沖液等的承載物。醫(yī)療級聚丙烯(PP)材質(zhì)因其*的純凈度和穩(wěn)定性,能更好適應(yīng)PCR反應(yīng)過程中反復(fù)高低溫設(shè)定,并且能夠?qū)崿F(xiàn)高溫高壓滅菌操作,常常被用于PCR耗材的生產(chǎn)。隨著熒光定量PCR技術(shù)的普及,該技術(shù)被廣泛用于遺傳、生化、免疫、醫(yī)藥等領(lǐng)域,不僅應(yīng)用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的研究領(lǐng)域。

  如何正確使用96孔PCR孔板?

  >PCR板有透明和乳白色可選,其中乳白色更適合用于頂部采集熒光信號的新型熒光定量PCR儀(如伯樂CFX系列,ABI 7500fast 以上型號, Roche 480系列),但如果熒光定量PCR儀是底部光源的,則應(yīng)選擇透明的。

  >PCR板根據(jù)裙邊設(shè)計又可分為無裙邊、半裙邊和全裙邊三種設(shè)計模式,不同廠家的熒光定量PCR儀會設(shè)計不同的切角或邊緣凸起,請選擇適合該P(yáng)CR儀的板子。

  >PCR板又分100ul體積(矮板)和200ul體積(高板),根據(jù)機(jī)型的不同選擇,選擇不同高度孔板,避免高度錯誤對機(jī)器造成破壞和加熱不均導(dǎo)致數(shù)據(jù)失真。

  >當(dāng)使用96孔板做熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的時候,推薦使用光學(xué)膜代來密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是:先沿著96孔板的縱向壓膜,然后橫向,最后沿著板的邊緣按壓使之密封。具體手法見下面圖示:

  加樣后會在管壁上飛濺一些小液滴,另外反應(yīng)體系內(nèi)也會有一些氣泡,需要離心去掉掛壁液滴和氣泡。請使用專用的微孔板離心機(jī)解決上述問題。

  PCR板屬于一次性消耗品,生產(chǎn)一次成型,不建議剪開使用容易造成實(shí)驗(yàn)誤差增加,不能清洗或部分重復(fù)利用。不要為了節(jié)省一點(diǎn)小錢,而給實(shí)驗(yàn)帶來后續(xù)分析上的困擾。

  樣本量少,用8聯(lián)管做實(shí)驗(yàn)又該注意哪些呢?

  >8聯(lián)管也分乳白和透明兩種,選擇方式和孔板一樣,根據(jù)PCR儀的熒光信號采集方式?jīng)Q定。

  >8聯(lián)管同樣也有0.1ml(矮管)和0.2ml(高管),根據(jù)PCR儀的加熱模塊體積確定。


  >8聯(lián)管的蓋子一般有光學(xué)平蓋和凸型圓蓋之分,光學(xué)平蓋適用于熒光定量PCR,圓蓋適用于普通PCR。

  >使用單管或8聯(lián)管做實(shí)驗(yàn),并且樣本數(shù)量不多的時候,建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品,最好是縱向放置,并且優(yōu)先放在第6列或第7列,然后逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至于發(fā)生傾斜,各個反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻,提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性。也可以在加熱模塊四角的位置,放置4個單管平衡熱蓋壓力,避免擴(kuò)增少量樣本時出現(xiàn)管子變形的情況。

  >管蓋沒有蓋好造成PCR反應(yīng)液熱蒸發(fā),影響反應(yīng)溫度的準(zhǔn)確控制及反應(yīng)也各成份的濃度,同時也成為一個污染源。不但會因壓蓋時由于粗心或者用力不均致使部分蓋子變形,而且還會造成樣品的交叉污染,所以我們推薦用獨(dú)立管蓋的8聯(lián)管,每管蓋一體,確保樣本獨(dú)立反應(yīng),避免交叉污染。


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